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氢气能否杀死癌细胞,氢对活性氧的清除和对肿瘤的防治效应

来源:氢气控癌:理论和实践 编辑:James&Ani 时间:2019-06-13 08:52:55

这篇研究阐述了氢气对活性氧的清除和对肿瘤的防治效应,氢气不是杀死癌细胞而是对活性氧的清除,才产生防治效应的。

氢对活性氧的清除和对肿瘤的防治效应

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阅读要点

●和一般的抗氧化剂相比,氢气具有选择性、扩散性、无害性,可能在肿瘤的防治中发挥独特的用,如避免一些抗氧化剂所谓的“促氧化作用”。

●由于肿瘤的异质性,抗癌药物都有其适用的范围,氢气的抗肿瘤效果也呈现出了有效、无效和可能有害的几种情况。

1975年美国 Baylor大学的Dole等[1]在国际知名学术期刊 Science杂志发表了一篇令人震惊的文章,作者发现氢气在975%的高浓度下可以抑制小鼠鳞状上皮细胞癌,一举颠覆了人们对氢气是生理惰性气体的传统认知。但氢气抑制癌细胞的分子机制一直没有进展。直到2007年,日本医科大学老年医学研究所的太田成男等[2]发现使用低到2%的安全剂量的氢气就可以发挥生物学效应,而且证明氢气具有选择性抗氧化作用,从此开启了氢分子生物学功能研究热潮。

众所周知,正常细胞内活性氧(ROS)的产生与清除保持着动态平衡,ROS水平相对较低;而肿瘤细胞由于基因的改变导致ROS代谢异常,其产生的高水平ROS可促进肿瘤的发生和发展,也为氢气通过清除RoS机制防治肿瘤提供了可能。2009年日本Itoh等[3]提出氢气可以作为第二信使的假说,因证据不足未获公认。而实际上,有些ROS本身就可以作为第二信使激活细胞内的增殖和抗氧化信息通道。针对肿瘤细胞ROS的治疗即所谓氧化-还原疗法,其中进一步升高细胞内ROS水平的为氧化疗法,降低ROS水平的为还原疗法。从广义上,氢气对肿瘤的作用属于还原疗法,因为其对人体无害且易穿过各种生物膜,相较于其他还原剂,人们有理由推测氢气在肿瘤防治中的前景值得期待。

一、氢气与ROS

人们长期认为氢气是一种惰性气体,故氢气与氧气加压混合后一直用作潜水员在水下呼吸的气体。太田成男[2]等利用细胞和不含细胞的纯溶液,结合荧光探针、电子自旋共振等方法,把氢气的靶分子明确定位为羟自由基(•OH•)和亚硝酸阴离子(ONOO-)。对后者的研究仅限于无细胞的纯溶液,且作用较弱,所以氢气的靶分子主要是•OH•。这一结果证实了人们长久以来的推测,即氢气在组织细胞内具有还原作用。更为重要的是,氢气的抗氧化作用仅仅局限于对•OH•和ONOO-的直接清除。氢气不能清除其他的活性氧分子(如O-2和H2O2),也不能还原OH-和其他分子结

合形成的氧化产物,对线粒体氧化呼吸链中氧化态的分子也没有还原作用(即不干扰线粒体的功能)。人们猜测氢气可能对癌细胞的自由基代谢具有一定作用。有研究用肠腺癌Caco-2细胞进行的实验表明,氢气不但明显降低抗霉素A导致的细胞内OH-升高,而且明显降低O-2和H2O2的水平。至少在恶性肿瘤细胞上,这结果对氢气清除自由基的高度选择性提出了质疑。日本Itoh等[3,4]利用炎细胞进行的研究发现,lgE对肥大细胞、 LPS/IFN对巨噬细胞的激活被氢气所抑制。虽然两种细胞内ROS水平都升高,但氢气要么对ROS升高没有影响(巨噬细胞),要么在主要降低O-2和H2O2的同时抑制 NADPH氧化酶的激活(肥大细胞)。根据太田成男等的研究结果,氢气并不直接清除O-2和H2O2,所以两者水平的降低是氢气抑制 NADPH氧化酶的结果。总之,因为氢气对两种炎细胞活化的信息通道都具有抑制作用,在排除了氢气直接清除ROS的可能性之后,Itoh等提出了氢气同CO、H2S、NO一样为细胞内第二信使的假设。遗憾的是,由于没有确定具体的靶分子,这一假说仍有待证明。考虑到细胞内信息转导途径的复杂性,可以预计,这将是一项艰难的工作,也是目前少有研究和结果令人满意的原因。

另外,根据生物病理学原理,如氢气升高细胞内Nf2和SOD等抗氧化分子,似乎和清除自由基的作用相矛盾,因为上述蛋白表达增强属于细胞对ROS的反应,ROS被氢气及时清除,Nf2和SOD应该相应降低。用氢气通过减轻氧化损伤从而保持细胞对ROs的反应能力解释这一实验现象似乎有些牵强。因此,除直接清除自由基外,氢气可能还存在其他的作用机制。中国Shi等[5]受到金属有机化学里金属可以和氢分子直接结合形成稳定化合物的启发,提出氢气的靶分子可能是体内金属蛋白里的金属离子。因为金属蛋白在体内尤其是氧化呼吸链广泛存在这一假设的后果就是氢气会干扰体内众多的代谢,尤其是氧化磷酸化的过程,这和太田成男等观察到氢气并不干扰氧化呼吸链的结果不相符。

从ROS的角度观察氢气或许有助于理解氢气的实验现象。比如,ROS对细胞的影响非常广泛,既有直接的氧化损伤,也有间接对信号通道的调节[6-8]。氢气对多种组织细胞病理生理的影响,可能最终要根据ROS的生物作用作出合理的解释。可以预见,对氢气的研究和对ROS的研究可以相辅相成、相互促进。

二、ROS与肿瘤

ROS主要是O2部分还原的产物,包括O-2、H2O2、•OH。线粒体是产生ROS的主要部位,一些生物氧化反应,如过氧化物酶体的β-氧化也会产生ROS。另外,细胞具有清除ROS的系统,包括酶类抗氧化剂如超氧化物歧化酶(SOD);非酶类抗氧化剂如 NADPH,主要为还原反应提供还原当量。ROS与细胞内氧化还原电势互为影响。GSH和其氧化物GSSG的比值GSH/GSSG)是维持氧化还原电势主要的缓冲对。 NADPH主要由磷酸戊糖途径产生,是保持GSH/GSG稳定的重要因素。葡萄糖的磷酸戊糖途径(产生 NADPH)、氧化磷酸化(产生ROS)及蛋白质合成代谢(消耗 NADPH)等生化过程相互协调,保持细胞内氧化还原当量的平衡。所以,细胞内ROS的调控是一个复杂的体系[6-8]。

(1)一些肿瘤细胞内ROS异常:在细胞周期中,细胞内ROS水平稳定升高,抗氧化剂可使细胞被阻断在G1晚期[9,10]。早期的研究发现肿瘤细胞里的H2O2稳定升高。相对于子代肿瘤细胞,因为抗氧化能力强,肿瘤干细胞内的ROs水平反而较低。基因的突变是肿瘤细胞内ROs异常(升高)最重要的原因。癌蛋白如RAS、MYC等均提高细胞内ROS水平[11]。如RAS通过增强 NADPH氧化酶(NOX)及降低化分子 sestrin I提高O-2;过多的ROS通过ERK1/2提高 cyclin D1水平,继而促进RB磷酸化,释放E2F1促使细胞从G1期向S期转化[12]。

抑癌蛋白RB、BRCA1等抑制ROS的产生并促进其代谢,如BRCA1通过上调抗氧化基因谷胱甘肽S-转移酶等,降低细胞内ROS水平[13]。一些癌蛋白和抑癌蛋白对ROS有双向调节,发挥稳定ROS水平的作用。非应激状态下,癌蛋白BCL-2通过增强线粒体的氧化磷酸化使O-2增多;应激状态下,BCL-2对O-2的过度升高反而有抑制作用。中低水平升高的ROS增强P53表达,激活ROS清除途径;ROS水平过高,P53反而激活ROS产生途径,通过进一步提高ROS水平诱导细胞凋亡[11]。另外,肿瘤细胞浸润转移(EMT)会因为基因表达的改变升高ROS水平[10]。肿瘤微环境炎细胞的浸润,缺氧和营养失衡都可使肿瘤细胞内ROS水平升高[13-15]。

(2)ROS对细胞的影响(细胞的氧化应答):被ROS激活的信息通道不仅调节氧化还原代谢,对细胞的增殖、凋亡和老化也具有作用,所以ROS具有第二信使的功能,其重要机制是一些蛋白的关键结构域的半胱氨酸巯基易于被ROS可逆性氧化形成二硫键(-SH+-SH→-S-S)-。

这些蛋白包括转录因子,如p53,信息转导蛋白,如RAS,灭活蛋白的蛋白酶体等等[9-11]。涉及的信息分子如HIF1,TGF-B/ SMADs和KEAP1/NRF2复合物活化细胞应激通道,有保护细胞、抑制凋亡、促血管生成的作用[9]。而NF-KB的激活与炎症因子的合成释放,PKC-MAPK通道与癌细胞的增殖有关[12]。ROS对增殖通道和抗氧化通道/应激通道的协同激活,使肿瘤细胞在增殖的同时避免了ROS过高导致的凋亡。因此,有的学者把肿瘤细胞内NRF2等抗氧化系统也看成癌蛋白成分。除了激活凋亡通道,急性高水平的ROS可以直接破坏细胞大分子结构促使细胞死亡。抑癌基因如P53、一些化药物、放射治疗都通过提高ROS水平诱导细胞凋亡[9-12]。ROs对不同种类和时期的肿瘤细胞作用不同,如O-2的减少对黑色素瘤具有抑制作用,却增强了纤维肉瘤细胞的侵袭能力。在早期的肿瘤,ROS升高通过激活P53等途径诱导凋亡;在进展期和晚期肿瘤,上述途径的失活会提高肿瘤细胞对ROS的耐受性。另外,难治性肿瘤或者肿瘤干细胞因为抗氧化能力强,对ROS的耐受性也比较强[10]。

(3)利用ROS预防和治疗肿瘤:ROS促进肿瘤的发生发展为还原疗法提供了依据。相对于正常细胞,肿瘤细胞内高水平的ROS使得肿瘤细胞对ROs的进一步升高更为敏感,氧化疗法又成为一个可以利用的选择。还原疗法试图通过降低RoS水平,抑制增殖通道的激活和DNA突变,阻止肿瘤的发生发展,可以应用ROS清除剂、促ROS酶抑制剂以及抗ROS酶激活剂[13-15]等。这一疗法的细胞和动物实验效果比较明显,但临床研究(服用维生素A、E硒、β-胡萝卜素)的结果差别很大,有研究甚至认为这些抗氧化剂提高了癌症的发生率削弱了其他抗癌治疗的效果[13-15]。这种情况可能是肿瘤细胞氧化-还原紊乱多样性的结果。

氧化疗法则利用ROS的细胞毒性直接杀灭肿瘤细胞,包括促进ROS的产生和或抑制ROs的清除。肿瘤干细胞内ROS水平较低,可能对治疗不敏感而存活下来[13];提高ROS水平还有可能在肿瘤细胞,甚至是正常细胞诱导更多的突变,导致抗药性[10]。这些情况都可能限制氧化疗法的应用。理论上推测,ROS紊乱的肿瘤细胞,如果处于无转移的早期,DNA改变较小,抗氧化治疗可能阻止肿瘤的发生和发展;如果DNA改变较重,已经出现浸润转移,升高RO促进凋亡可能更为有效[13]。目前已经筛选出些对疗效具有预测作用的指标,如监测胰腺癌和肝癌病人血浆硫氧化还原蛋白和VEGF水平可以评估硫氧化还原蛋白抑制剂的疗效;PET扫描肿瘤细胞的葡萄糖摄取率和缺氧程度,能使和代谢与缺氧相关的促ROS药物更具有针对性。这些指标的筛选、应用,会使氧化还原抗肿瘤治疗更为个性化[16]。

三、氢气与肿瘤的预防和治疗

目前的一些研究结果已经证明了氢气在肿防治方面的作用[17-20]。

预防方面,在60Co、链脲霉素、氮基三醋酸铁诱导的胸腺淋巴瘤、肝细胞肝癌、肾细胞癌鼠模型,氢气水的应用降低了肿瘤的发生率,并使形成的肿瘤体积减小,潜伏期延长。其中,氮基三醋酸铁腹腔注射诱导 Wistar鼠肾细胞癌的研究已进行了短期(1周)、中期(12周)、长期(49周)的观察。短期氢气干预降低了肾匀浆内DNA对3-胸腺嘧啶的摄取率和鸟氨酸脱羧酶的活性;OONO-、MDA生成减少, NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、HO-1等酶的活性下降;中期干预减少了肾匀浆内VEGF、PCNA的表达,以及STAT3的磷酸化;长期干预减少了肾细胞癌的发生率和肿瘤的平均大小。以上研究表明,氢气有通过抗氧化机制降低动物模型肿瘤的发生率和严重程度的作用。

治疗方面,前已述及早在1975年Dole等就以无毛白化小鼠为对象,通过紫外线照射诱导皮肤鳞状细胞癌后,观察高压氢气(97.5%氢气,2.5%氧气,8.28大气压)的作用。结果令人惊讶:肿瘤缩小,部分脱落消失,达到了治愈的效果。但同样令人惊讶的是,此后再也没有类似的报道。近来的研究多以肿瘤细胞,少数以鼠为实验对象。肿瘤细胞株包括结肠腺癌、人舌癌、人肺腺癌、人纤维肉瘤、 Ehrlich腹水肿瘤等多种细胞。培养液中加入氢气干预,降低了肿瘤细胞的转移能力(集落数量和每集落的细胞数)和浸润能力(穿越重组基底膜的细胞数),提高了细胞的退化和凋亡率。

重要的是,氢气降低人舌癌细胞株HSC-4的集落数量和每个集落的细胞数,但不影响正常人舌上皮样细胞DOK的集落形成,说明氢气具有选择性的抗肿瘤效果[18]。氢气的抗癌作用和降低细胞内ROS水平,降低MAPK活性,提高凋亡酶如 Caspase3活性有关。氢气还通过抑制人肺腺癌细胞株A549内EGF的转录及分泌,减少A549培养液诱导的血管生成。

值得注意的是,氢气虽然促进 colon 26细包株的凋亡,但不能提高 colon 26注射所诱导肿瘤的数量和体积,以及带瘤BALB/c鼠的生存率[20]。氢气对肝癌细胞系HepG2无抑制作用;在抗霉素A所诱导的氧化应激中,氢气对肠腺癌Caco-2细胞反而具有保护作用。另外,作为辅助干预,氢气具有减少其他抗肿瘤治疗副作用的效果。氢气能够减少顺铂治疗C57BL/6鼠移植肿瘤的肾脏毒性,改善接受放射治疗的肝肿瘤患者的身体状态和生活质量。在这些研究中,氢气对肿瘤本身并不产生影响。

以上研究表明,氢气对一些肿瘤具有预防和治疗作用,并且表现出对肿瘤细胞的选择性。对另一些肿瘤,氢气则没有治疗作用;而在急性氧化应激条件下,氢气有可能反而保护肿瘤细胞。

结语

氢气防治肿瘤的研究数量很少,涉及的肿瘤细胞和动物不多,尚无随机对照下的临床试验报告。以后的工作应该在以下方面展开:①加强细胞水平的研究,以更多更丰富的肿瘤细胞种类进行氧化应激条件和抗氧化应激条件下的研究,聚焦治疗效果,并按照有效、无效和有害进行分类。②加强动物水平的整体研究,在基因和表型等方面探讨肿瘤发生发展不同时间段的氢气生物医学效应。③加强临床水平的研究,针对肿瘤人群尤其是恶性肿瘤人群的实际情况,开展真实数据的研究,即完整记录一个个个体的治疗经过,积累一定的病案数量,求得真实地反映某一类肿瘤患者的疗效程度。④探寻氢气与其他抗肿瘤治疗的联合应用模式,比如化疗、放疗、热疗等方法基础上的氢气联合治疗试验[19-21]。有些动物实验和人群试验工作涉及的面很广,需要多学科研究者团结协作,共同完成。

秦树存 周晓

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